邻近化学标记技术已广泛用于研究蛋白质相互作用及空间蛋白质组学，但在细胞相互作用领域的实际应用仍不多。该工作在发明了一种全新的邻近酶化学标记技术的基础上成功展示了该类化学生物学工具在肿瘤免疫领域的重要应用，为利用邻近标记技术研究细胞相互作用提供了全新的思路。
以免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICI）和过继细胞疗法（Adoptive Cell Transfer, ACT）为代表的肿瘤免疫治疗手段颠覆了人们对于肿瘤治疗的认知，并于2018年获得诺贝尔生理医学奖。通常认为，肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating Lymphocytes , TILs）中的肿瘤特异抗原(Tumor Specific Antigen, TSA)反应性T细胞（TSA-reactive T cells）的再激活和克隆扩增是ICI疗法成功的基础，而TILs中同时存在TSA反应性T细胞和“旁观者”T细胞（bystander T cells）。目前还没有简单可靠的细胞表面标志物来特异性地识别TSA反应性T细胞，从而精确地研究它们的表型与功能。因此，发展一种快速、直接的方法来鉴定和分离癌症病人体内的TSA反应性T细胞将有助于加深对肿瘤免疫微环境的生物学理解同时加速相关的转化研究。
2020年10月22日，美国Scripps研究所在Cell杂志上发表了题为“Detecting Tumor Antigen-Specific T Cells via Interaction-Dependent Fucosyl-Biotinylation”的研究论文，南京大学化学和生物医药创新研究院李劼博士、美国Scripps研究所的刘子雷博士、陈明宽博士为本文的共同第一作者，吴鹏教授和李劼博士为文章的共同通讯作者。该研究开发了一种基于细胞-细胞相互作用的邻近标记方法，成功地将TSA反应性T细胞与旁观者T细胞在TILs中区分开来，并进一步分析了TSA反应性T细胞与旁观者T细胞在功能和转录水平的差异，分离鉴定了一种新的PD-1阳性的旁观者T细胞亚群，为TILs的基础研究提供了全新的方法，也为更加精准的TILs疗法提供了经济快速的分离手段。
在之前的TILs研究中，研究人员通过逆向免疫学的方法，结合全外显子测序，生物信息学分析，机器学习等手段预测肿瘤中的TSA，再利用对应的荧光标记的主要组织相容性复合体（MHC）的多聚体对单一抗原的特异T细胞进行染色，这样的策略耗资巨大，周期长，且无法获得所有的TSA反应性T细胞。
研究团队利用DC细胞能够吞噬、分解、呈递肿瘤抗原的特性，发展了基于活细胞的标记策略（类比多聚体染色），通过细胞间相互作用介导的邻近标记（生物素标签）来实现多数TSA反应性T细胞的“染色”，直接绕过了TSA的鉴定。该工具基于李劼博士在吴鹏课题组进行博士后研究期间的意外发现：一种细菌中的岩藻糖基转移酶（H. pylori a(1,3)Fucosyltransferase, FT）具有极强的底物兼容能力，可以快速将其供体底物（鸟苷二磷酸岩藻糖，GF）与蛋白质的偶联物作为整体快速转移至其另外一个受体底物LacNAc上，而LacNAc作为一个二糖单元广泛存在于多种细胞表面。通过构建FT酶与其底物的自催化复合物（GF-FT），可以在多种原代免疫细胞上安装能够实现细胞间邻近标记的酶FT。
作者将DC细胞作为诱饵细胞（bait cell），通过与预先化学合成的GF-FT复合物孵育20分钟，即可构建出DC-FT细胞偶联物。若诱饵细胞在体系中与猎物细胞（prey cell）发生相互作用，FT即可将其生物素化的供体底物（GF-Biotin）转移至猎物细胞表面的LacNAc上，从而实现猎物细胞的标记，该方法被命名为FucoID技术（图1）。
图1. FucoID技术示意图
在完成体系验证后，作者将FucoID运用于捕捉和鉴定TILs中TSA反应性T细胞（图2）。在小鼠黑色素瘤模型（B16），三阴性乳腺癌模型（E0771）和结肠癌模型（MC38）中均捕获了相应的CD8+TSA反应性T细胞，并通过对比PD-1+Bio+亚群，PD-1+Bio-亚群或PD-1-亚群的抗原识别能力，肿瘤杀伤能力和TCR克隆多样性等确定PD-1+Bio+亚群为“真正的”CD8+ TSA反应性T细胞，而PD-1+Bio-则是一类新的CD8+旁观者T细胞（图3）。CD8+ TSA反应性T细胞在体外扩增后相比其它旁观者T细胞在活体模型中表现出更强的抗肿瘤能力。
进一步的转录组测序发现，CD8+ TSA反应性T细胞（PD-1+Bio+）和CD8+旁观者T细胞中的PD-1+Bio-亚群虽然表型相近但仍有差别，CD8+ TSA反应性T细胞的TCR克隆多样性分数低，表现出类似于激活/功能紊乱（activation/dysfunction）的表型，且显著上调了类固醇生物合成的相关基因。此外，CD8+ TSA反应性T细胞和CD8+旁观者T细胞的TCR克隆型重叠度很低，说明通过FucoID技术可以捕获绝大多数的CD8+ TSA反应性T细胞，不会出现“漏网之鱼”。
图2. FucoID在肿瘤中筛选TSA反应性T细胞的流程
最后，为了分析CD4+ TSA反应性T细胞在肿瘤免疫治疗中的调节作用，作者在Pan02小鼠胰腺导管腺癌模型中进行FucoID实验捕获CD4+ TSA反应性T细胞，发现在肿瘤微环境中存在抗原抑制性和抗原反应性CD4+ T细胞，发挥调节CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫功能。这也说明相较于预测抗原肽的多聚体染色技术，FucoID技术能够很好地兼容I型和II型MHC分子，具有更广的应用前景。
图3. 文章整体设计思路
总结：李劼博士的此项研究开发了一种称为FucoID的细胞-细胞相互作用的邻近标记方法，能够快速地将地将TSA反应性T细胞与旁观者T细胞在TILs中区分开来，进而可以深入研究其生物学特征。FucoID不需要依赖于基因操作手段，适用于原代细胞的研究，并且操作流程相对简单，周期短，具有进一步临床应用的潜力，为加速TILs疗法的发展，助力肿瘤免疫疗法的个性化治疗提供了有力工具。
